Embriogénesis somática en pino piñonero ("Pinus pinea" L.)

El pino piñonero (Pinus pinea L.) es una de las especies arbóreas más características de la flora mediterránea, con gran importancia ecológica, social y económica. Debido a su rusticidad y porte aparasolado puede considerarse como especie destinada a usos paisajísticos y recreativos, pero su aprovechamiento principal es el fruto (piñones comestibles), siendo España uno de los países con mayor producción. La mejora genética de esta especie va orientada fundamentalmente a una utilización agronómica y requiere la identificación de individuos buenos productores de piña y piñón. El pino piñonero se muestra recalcitrante en su capacidad morfogénica, por lo que es necesario desarrollar técnicas de propagación vegetativa eficaces que permitan la mejora de esta especie. La embriogénesis somática es un proceso in vitro que incluye el desarrollo de masas embriogénicas en embriones bipolares capaces de madurar, germinar y aclimatarse a condiciones ex vitro. Hoy se considera como la vía más adecuada para la micropropagación clonal de especies forestales, alcanzándose recientemente grandes progresos en las coníferas. Este trabajo se ha centrado en el estudio de determinados aspectos de la embriogénesis somática, utilizada como vía para la regeneración clonal de árboles selectos de pino piñonero, siendo la primera vez que se ha abordado esta técnica de micropropagación en esta especie. La memoria de tesis se ha dividido en varios capítulos, que se corresponden con las sucesivas fases del proceso: inducción de la respuesta embriogénica, proliferación y mantenimiento del material embriogénico inducido, maduración de los embriones somáticos, germinación y conversión de los embriones en plantas. Además se ha evaluado el efecto de la crioconservación sobre la recuperación del crecimiento de distintas líneas embriogénicas. Se ha estudiado la respuesta embriogénica de diferentes tipos de explantos, tanto embrionarios (embriones cigóticos maduros e inmaduros) como no embrionarios (estróbilos femeninos, estróbilos masculinos, acículas en expansión, yemas y hojas de inserción aislada). Para ello se han ensayado distintas condiciones de inducción, donde se ha evaluado la influencia de factores como el genotipo, la composición del medio nutritivo, y tipos y niveles de reguladores del crecimiento. Únicamente se ha conseguido la respuesta embriogénica a partir de explantos embrionarios, aunque con los no embrionarios se han obtenido respuestas prometedoras. Las mayores frecuencias de inducción se han obtenido con los embriones cigóticos inmaduros. El protocolo de inducción se ha basado en el cultivo de megagametofitos completos, la aplicación de los reguladores del crecimiento 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) y BAP (6-bencilaminopurina), y un aporte de nitrógeno orgánico. El tejido embriogénico aparece en forma de extrusión en el extremo del micropilo del megagametofito. La proliferación del material embriogénico se ha llevado a cabo en el medio de inducción modificado, manteniéndose ésta capacidad proliferativa con el tiempo, siendo su potencial multiplicativo muy alto. Para el mantenimiento de las líneas embriogénicas se han realizado subcultivos bisemanales a medio de cultivo fresco. La diferenciación de los embriones somáticos ha requerido un precultivo de las masas embriogénicas en medio con los nutrientes reducidos y bajas concentraciones de reguladores; posteriormente, las masas se han disgregado en medio con carbón activo, cultivándose en presencia de ABA (ácido abscísico) y alto contenido osmótico. La desecación parcial de las masas embriogénicas ha favorecido la maduración. Cuando los embriones alcanzan el estado cotiledonar se ha procedido a su germinación, y a la transferencia a condiciones ex vitro de las plantas somáticas para su aclimatación. Las frecuencias de iniciación de tejido embriogénico en el pino piñonero han sido relativamente bajas, pero similares a las obtenidas inicialmente en otras especies del género Pinus. Se sugiere la existencia de una ventana en el desarrollo del embrión cigótico más sensible a la inducción, pues las mayores respuestas se han obtenido cuando el embrión se encontraba entre el estado de poliembrionía de partición y el estado cotiledonar inicial. El medio de cultivo y los reguladores del crecimiento también han influido en las frecuencias de iniciación, obteniéndose los mejores resultados con el medio Litvay modificado, suplementado con L-glutamina e hidrolizado de caseína y la combinación de 9 ?M de 2,4-D y 4,5?M de BAP. Se ha observado una fuerte influencia del genotipo en las fases de inducción, proliferación y maduración de los embriones somáticos. La maduración de los embriones somáticos se ha visto afectada por la elevada de proliferación de los cultivos, no obstante se han obtenido tasas de maduración similares a las de otras especies de pinos. La germinación de los embriones somáticos se ha mejorado realizando un tratamiento pregerminativo de los cultivos en frío. La germinación de los embriones se ha visto influída por su posición en los medios de cultivo, obteniéndose mayores frecuencias cuando se disponen en las placas en posición horizontal y éstas se inclinan 40º. El desarrollo de las plántulas se ha estimulado modificando el medio de cultivo y la intensidad luminosa. Se ha logrado la regeneración de plantas a partir de los embriones germinados, a través de la optimización de las fases de maduración y germinación. Se ha desarrollado un protocolo de crioconservación de líneas embriogénicas de pino piñonero, lo que evitaría la pérdida de vigor y capacidad morfogénica de las masas embriogénicas por el cultivo prolongado. Se ha evaluado la influencia de los agentes crioprotectores (sorbitol y DMSO) en la viabilidad del material embriogénico, observándose un cierto grado de toxicidad que revierte con los subcultivos además de la influencia del genotipo en la respuesta. La recuperación del crecimiento de las líneas embriogénicas crioconservadas pasa por una fase de latencia, igualándose al crecimiento de las líneas no crioconservadas con los subcultivos. La mezcla de 0,4 M de sorbitol y 15 % de DMSO ha proporcionado la mayor tasa de recuperación. Ha sido posible la maduración y germinación de los embriones somáticos procedentes del material crioconservado, obteniéndose embriones capaces de convertirse en plantas

Embriogénesis somática en pino piñonero ("Pinus pinea" L.)

El pino piñonero (Pinus pinea L.) es una de las especies arbóreas más características de la flora mediterránea, con gran importancia ecológica, social y económica. Debido a su rusticidad y porte aparasolado puede considerarse como especie destinada a usos paisajísticos y recreativos, pero su aprovechamiento principal es el fruto (piñones comestibles), siendo España uno de los países con mayor producción. La mejora genética de esta especie va orientada fundamentalmente a una utilización agronómica y requiere la identificación de individuos buenos productores de piña y piñón. El pino piñonero se muestra recalcitrante en su capacidad morfogénica, por lo que es necesario desarrollar técnicas de propagación vegetativa eficaces que permitan la mejora de esta especie. La embriogénesis somática es un proceso in vitro que incluye el desarrollo de masas embriogénicas en embriones bipolares capaces de madurar, germinar y aclimatarse a condiciones ex vitro. Hoy se considera como la vía más adecuada para la micropropagación clonal de especies forestales, alcanzándose recientemente grandes progresos en las coníferas. Este trabajo se ha centrado en el estudio de determinados aspectos de la embriogénesis somática, utilizada como vía para la regeneración clonal de árboles selectos de pino piñonero, siendo la primera vez que se ha abordado esta técnica de micropropagación en esta especie. La memoria de tesis se ha dividido en varios capítulos, que se corresponden con las sucesivas fases del proceso: inducción de la respuesta embriogénica, proliferación y mantenimiento del material embriogénico inducido, maduración de los embriones somáticos, germinación y conversión de los embriones en plantas. Además se ha evaluado el efecto de la crioconservación sobre la recuperación del crecimiento de distintas líneas embriogénicas. Se ha estudiado la respuesta embriogénica de diferentes tipos de explantos, tanto embrionarios (embriones cigóticos maduros e inmaduros) como no embrionarios (estróbilos femeninos, estróbilos masculinos, acículas en expansión, yemas y hojas de inserción aislada). Para ello se han ensayado distintas condiciones de inducción, donde se ha evaluado la influencia de factores como el genotipo, la composición del medio nutritivo, y tipos y niveles de reguladores del crecimiento. Únicamente se ha conseguido la respuesta embriogénica a partir de explantos embrionarios, aunque con los no embrionarios se han obtenido respuestas prometedoras. Las mayores frecuencias de inducción se han obtenido con los embriones cigóticos inmaduros. El protocolo de inducción se ha basado en el cultivo de megagametofitos completos, la aplicación de los reguladores del crecimiento 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) y BAP (6-bencilaminopurina), y un aporte de nitrógeno orgánico. El tejido embriogénico aparece en forma de extrusión en el extremo del micropilo del megagametofito. La proliferación del material embriogénico se ha llevado a cabo en el medio de inducción modificado, manteniéndose ésta capacidad proliferativa con el tiempo, siendo su potencial multiplicativo muy alto. Para el mantenimiento de las líneas embriogénicas se han realizado subcultivos bisemanales a medio de cultivo fresco. La diferenciación de los embriones somáticos ha requerido un precultivo de las masas embriogénicas en medio con los nutrientes reducidos y bajas concentraciones de reguladores; posteriormente, las masas se han disgregado en medio con carbón activo, cultivándose en presencia de ABA (ácido abscísico) y alto contenido osmótico. La desecación parcial de las masas embriogénicas ha favorecido la maduración. Cuando los embriones alcanzan el estado cotiledonar se ha procedido a su germinación, y a la transferencia a condiciones ex vitro de las plantas somáticas para su aclimatación. Las frecuencias de iniciación de tejido embriogénico en el pino piñonero han sido relativamente bajas, pero similares a las obtenidas inicialmente en otras especies del género Pinus. Se sugiere la existencia de una ventana en el desarrollo del embrión cigótico más sensible a la inducción, pues las mayores respuestas se han obtenido cuando el embrión se encontraba entre el estado de poliembrionía de partición y el estado cotiledonar inicial. El medio de cultivo y los reguladores del crecimiento también han influido en las frecuencias de iniciación, obteniéndose los mejores resultados con el medio Litvay modificado, suplementado con L-glutamina e hidrolizado de caseína y la combinación de 9 ?M de 2,4-D y 4,5?M de BAP. Se ha observado una fuerte influencia del genotipo en las fases de inducción, proliferación y maduración de los embriones somáticos. La maduración de los embriones somáticos se ha visto afectada por la elevada de proliferación de los cultivos, no obstante se han obtenido tasas de maduración similares a las de otras especies de pinos. La germinación de los embriones somáticos se ha mejorado realizando un tratamiento pregerminativo de los cultivos en frío. La germinación de los embriones se ha visto influída por su posición en los medios de cultivo, obteniéndose mayores frecuencias cuando se disponen en las placas en posición horizontal y éstas se inclinan 40º. El desarrollo de las plántulas se ha estimulado modificando el medio de cultivo y la intensidad luminosa. Se ha logrado la regeneración de plantas a partir de los embriones germinados, a través de la optimización de las fases de maduración y germinación. Se ha desarrollado un protocolo de crioconservación de líneas embriogénicas de pino piñonero, lo que evitaría la pérdida de vigor y capacidad morfogénica de las masas embriogénicas por el cultivo prolongado. Se ha evaluado la influencia de los agentes crioprotectores (sorbitol y DMSO) en la viabilidad del material embriogénico, observándose un cierto grado de toxicidad que revierte con los subcultivos además de la influencia del genotipo en la respuesta. La recuperación del crecimiento de las líneas embriogénicas crioconservadas pasa por una fase de latencia, igualándose al crecimiento de las líneas no crioconservadas con los subcultivos. La mezcla de 0,4 M de sorbitol y 15 % de DMSO ha proporcionado la mayor tasa de recuperación. Ha sido posible la maduración y germinación de los embriones somáticos procedentes del material crioconservado, obteniéndose embriones capaces de convertirse en plantas

Growth data from a field trial of Quercus suber plants regenerated from selected trees and their half-sib progenies by somatic embryogenesis

The development of reliable clonal propagation technologies is a requisite for performing Multi-Varietal Forestry (MVF). Somatic embryogenesis is considered the tissue culture based method more suitable for operational breeding of forest trees. Vegetative propagation is very difficult when tissues are taken from mature donors, making clonal propagation of selected trees almost impossible. We have been able to induce somatic embryogenesis in leaves taken from mature oak trees, including cork oak (Quercus suber). This important species of the Mediterranean ecosystem produces cork regularly, conferring to this species a significant economic value. In a previous paper we reported the establishment of a field trial to compare the growth of plants of somatic origin vs zygotic origin, and somatic plants from mature trees vs somatic plants from juvenile seedlings. For that purpose somatic seedlings were regenerated from five selected cork oak trees and from young plants of their half-sib progenies by somatic embryogenesis. They were planted in the field together with acorn-derived plants of the same families. After the first growth period, seedlings of zygotic origin doubled the height of somatic seedlings, showing somatic plants of adult and juvenile origin similar growth. Here we provide data on height and diameter increases after two additional growth periods. In the second one, growth parameters of zygotic seedlings were also significantly higher than those of somatic ones, but there were not significant differences in height increase between seedlings and somatic plants of mature origin. In the third growth period, height and diameter increases of somatic seedlings cloned from the selected trees did not differ from those of zygotic seedlings, which were still higher than data from plants obtained from somatic embryos from the sexual progeny. Therefore, somatic seedlings from mature origin seem not to be influenced by a possible ageing effect, and plants from somatic embryos tend to minimize the initial advantage of plants from acorn

Efecto de las características del biorreactor y de su manejo sobre el desarrollo de cultivos embriogénicos de alcornoque

En el marco del proyecto SEFEAL-2, liderado por TRAGSA, se aplican protocolos de embriogénesis somática (ES) para desarrollar variedades de alcornoque de alta calidad y productividad. Al mismo tiempo se mejora la técnica de ES para abaratar los costes y permitir su aplicación a escala comercial. En el alcornoque, como en otras especies, el desarrollo comercial de la embriogénesis como técnica de multiplicación masiva se basa en el uso de biorreactores y medios líquidos agitados. El diseño del biorreactor, su sistema de cierre y el nivel de agitación determinan el grado de mezclado, el estrés hidrodinámico y el intercambio gaseoso, y por ello afectan tanto al crecimiento como al desarrollo de los cultivos embriogénicos. Mediante un ensayo factorial se testaron 3 tipos de envase y tres niveles de agitación. Los efectos sobre el intercambio gaseoso se estimaron a través de la tasa de transferencia de O2 (OTR) y su coeficiente volumétrico de transferencia de masa (KLa), y los efectos sobre el nivel de mezclado mediante el “shear force index” (SFI), un indicador de estrés hidrodinámico. El tipo de envase afectó básicamente al número total de agregados embriogénicos y a la frecuencia de formación de los agregados de mayor tamaño. El nivel de agitación tuvo mayores efectos que el tipo de envase tanto sobre el número como sobre el tamaño de los agregados. Para las condiciones ensayadas, que dieron lugar a valores de KLa comprendidos entre 0,11 h-1 y 1,47 h-1, la disponibilidad de oxígeno no pareció limitante. En cualquier caso, los efectos del tipo de envase y del nivel de agitación sobre los procesos de crecimiento y desarrollo de los materiales embriogénicos de alcornoque fueron complejos resultando muy significativa la interacción tipo de envase por nivel de agitación

Somatic embryogenesis as a regeneration method for clonal propagation of Mediterranean forest species

La mejora y conservación de recursos genéticos en especies forestales lleva siglos de retraso con respecto a las especies agrícolas. Los recursos forestales se han considerado tradicionalmente como recursos �mineros�, en los que primaba la mera extracción dejando exclusivamente a la regeneración natural la labor de sostenibilidad en los montes y dehesas o montados. Hoy en día, el necesario desarrollo del medio rural obliga a la explotación racional de los recursos como medio de garantizar su sostenibilidad. Por ello se está empezando a extender el criterio de que las especies forestales se pueden y deben �cultivar� en determinados espacios. Las características biológicas de las especies forestales las hacen, a menudo, recalcitrantes a las técnicas de mejora y conservación de recursos genéticos tradicionalmente aplicadas a especies agrícolas. En particular, la propagación vegetativa se ha utilizado ampliamente en muchos cultivos leñosos como una herramienta muy poderosa para capturar todo el potencial genético de combinaciones genéticas valiosas. En especies forestales, en particular en las mediterráneas, esta posibilidad raramente se ha podido aplicar debido a la baja capacidad morfogénica de estas especies y la fuerte influencia de la maduración o cambio de fase. En los últimos años la biotecnología forestal ha tenido un desarrollo espectacular. En particular las técnicas de regeneración clonal de plantas basadas en técnicas de cultivo in vitro, fundamentalmente vía embriogénesis somática, se están ya aplicando por muchas empresas privadas e instituciones públicas a nivel semi-operativo con diversas especies, para la conservación de material selecto y el establecimiento de ensayos clonales. Nuestros grupos de trabajo están desarrollando protocolos de regeneración por embriogénesis somática en distintas especies forestales. En esta comunicación se presenta el estado actual de los conocimientos en dos especies típicamente mediterráneas, el alcornoque (Quercus suber L.) y el pino piñonero (Pinus pinea L.), destacando los principales cuellos de botella para su aplicación a gran escala

Plant regeneration from an endangered valuable cork oak tree by somatic embryogenesis.

Among the several applications of in vitro tissue culture techniques, the conservation of plant germplasm is one of the most widely used. The cork oak is one of the principal tree species in the Western Mediterranean región. Within this área, the Balearic Islands are considered to be a glacial refuge, and therefore a reservoir of genetic resources. A singular tree has been found in the small Minorca Island population. The haplotype of this tree is of Tyrrhenian origin, showing a past link between Minorca and Sardinia. Moreover, this tree do not bear a deletion within an ITS from ribosimic nuclear DNA, which is fairly common in many populations of this species, and indicates that ir may be the descendant of a very ancient population. This tree is currently in a precarious condition, and it has not produced acorns in the last years. Hence there is a clear need of vegetative propagation to conserve this genotype. We have previously developed methods to clone adult cork oak tres by somatic embryogenesis, and therefore the aim of the present work was to clone this singular tree. There braches from the corwn were collected in November 2004, and methods previously described were carried out. By February 2005 somatic embryogenesis was obtained from leaves of the tree with percentages on induction ranging from 17 to 54% depending on the branch, which may show a novel source of variation that requires further study. Spontaneously matured somatic embryos germinated at 46% in average, and the first somatic seedlings from the Alfavaret's cork oak tree were obtained. Therefore, this study shows one of the most relevant applications of somatic embryogenesis: the plant regeneration of valuable genotypes for the in situ and ex situ conservation of forest genetic resources

Identification of IL-6 Signalling Components as Predictors of Severity and Outcome in COVID-19

IL-6 is one of the major mediators of the hyper-inflammatory responses with complex biological functions as it can signal via different modes of action. IL-6 by classical signalling has anti-inflammatory and antibacterial activities, while trans-signalling mediates pro-inflammatory effects. The net biological effect of IL-6 is established by multiple factors beyond its absolute concentration. Here, we assess the relationship between IL-6 signalling variables [IL-6, soluble IL-6R (sIL-6R) and soluble gp130 (sgp130)] and outcomes in a cohort of 366 COVID-19 patients. The potential trans-signalling was evaluated by a ratio between the pro-inflammatory binary IL-6:sIL-6R complex and the inactive ternary IL-6:sIL-6R:sgp130 complex (binary/ternary complex) and the fold molar excess of sgp130 over sIL-6R (FME). Our data provide new evidence that high levels of IL-6, sIL-6R, sgp130, binary/ternary complex ratio, and low FME are independent predictors of COVID-19 severity in survivor patients (without death), and the combination of IL-6 + sIL-6R + sgp130 exhibited the most robust classification capacity. Conversely, in a subgroup of patients with a very poor prognosis, we found that high levels of IL-6 and low levels of sIL-6R, sgp130, and binary/ternary complex ratio were predictors of death. In this context, the highest predictive capacity corresponded to the combined analysis of IL-6 + FME + lymphopenia + creatinine. Herein, we present IL-6 signalling variables as a helpful tool for the early identification and stratification of patients with clear implications for treatment and clinical decision-making.The research work was supported by the Spanish Institute of Health Carlos III (COV-20/00792) and by the European Commission - NextgenerationEU (Regulation EU 2020/2094), through CSIC's Global Health Platform (PTI Salud Global). MAR-H acknowledges support from the Spanish Institute of Health Carlos III and the European Commission - NextgenerationEU (Regulation EU 2020/2094), through CSIC's Global Health Platform (PTI Salud Global). DC is supported by a predoctoral iPFIS (IFI 19/00048) funded by Spanish Institute of Health Carlos III. MN-N is supported by the Rio Hortega contract (CM20/00074)